ABSTRACT
El diseño de primers es una parte sustancial dentro de los ensayos de PCR, el mismo es aplicado en la caracterización de microorganismos, secuenciación, cuantificación, etc. En los últimos años se ha incrementado herramientas para este fin, se realizaron nuevas variantes, crearon nuevos enfoques, muchas de estas herramientas son de licencia comercial y otros de acceso libre y código abierto permiten al usuario mejorar o modificar según requerimiento el diseño de primers. En este trabajo comparamos las características básicas dentro del diseño de primers, empleando 2 tipos de herramientas web de acceso libre y código abierto: Primer-BLAST y Primer3Plus, se realizó el diseño in silico, análisis de estructuras secundarias y verificación de la especificidad de los primers obtenidos. Los resultados mostraron que el uso de variables adicionales o uso de penaltis mediante el software Primer3Plus afectan en la especificidad, formación de estructuras secundarias de los primers y de los amplicones. Además, se determinó que los parámetros que tienen muchos software por defecto, no aseveran el diseño de primers convenientes y/o específicos, en este sentido es importante realizar el uso de penaltis. Asimismo, se identificó que el uso de Primer3Plus ha permitido disminuir la formación de estructuras secundarias, sin afectar la especificidad de amplificación del marcador seleccionado.
Primer design is a substantial part of PCR assays, which is used in characterization of microorganisms, sequencing, quantification, etc. In recent years, new tools have been added for this purpose, new variants and approaches have been created, many of these tools are commercial and others are free including open source, giving the possibility to improve or modify as required. In this work, we compared the basic characteristics of the primers design, using 2 types of free and open source web tools, PrimerBLAST and Primer3Plus, in this sense the in silico design, analysis of secondary structures and verification of primers designed. The results showed that the use of additional variables or use of penalties using the software Primer3Plus affect in specificity, secondary structures formation in primers and in the products of amplification. In addition, default parameters, that many software have, do not imply that suitable and / or specific primers can be obtained, meaning the importance of the use of penalties. Therefore, the use of Primer3Plus has allowed to decrease the formation of secondary structures without affecting the amplification specificity of the selected marker.
Subject(s)
Polymerase Chain Reaction , Computer Simulation , Access to Information , LicensureABSTRACT
La necesidad de ampliar los conocimientos respecto a los mecanismos bioquímicos y fisiológicos desarrollados por los microorganismos presentes en suelos requiere de una descripción completa de la diversidad microbiana, para lo cual en las últimas décadas se han desarrollado diferentes técnicas moleculares (qPCR, DGGE, T-RFLP, RAPD.) las mismas que requieren una adecuada técnica de extracción de ADN que aseguren el éxito de la descripción de la diversidad microbiana, considerando las características de las muestras de suelos a ser estudiadas. Los protocolos de extracción de ADN generalmente utilizados están basados en la separación de los microorganismos de la matriz antes de la extracción de ADN mediante lisis física o química y por otro lado, la extracción directa del ADN microbiano a partir de muestras de suelo, sin embargo la presencia de sustancias húmicas y fenólicas afectan la calidad del ADN extraído, lo que repercuten en el desarrollo de posteriores estudios moleculares. La finalidad de este estudio fue la de establecer procedimientos de pre tratamientos de 3 tipos de nuestras de suelo (arenoso, arcilloso y francos) para posteriormente describir la riqueza y diversidad bacteriana de las muestras en estudio mediante PCR DGGE. De esta manera se determinó que la adición de CaCO3 en muestras de suelos francos permite la identificación de una mayor diversidad y riqueza bacteriana (10 bandas). Asimismo, la adición de PVPP a suelos arenosos (8 bandas) y arcillosos (3 bandas) también permite obtener las características descritas anteriormente utilizando el método PCR-DGGE. Lo cual indica que los procedimientos de pre tratamiento con CaCO3 y PVPP son específicos para la extracción de ciertas comunidades microbianas.
The knowledge about biochemical and physiological mechanisms by microorganisms in soils are required for a complete description of microbial diversity, lately different molecular techniques have been developed to study this feature (qPCR, DGGE, T- RFLP, RAPD). DNA extraction techniques ensure the description of the microbial diversity success, according the soil samples characteristics. Generally, DNA extraction protocols used for separation of microorganism of matrix soil before DNA extraction by physical and chemical lysis. Other protocol is direct extraction of microbial DNA from soil samples, humic acids and phenolic substances affect the quality of DNA, which affect the development of subsequent molecular studies. The purpose of this study was to establish pretreatment procedures for different kind of soil samples (frank, sandy and clayey) in order to describe richness and bacterial diversity by PCR DGGE. In this sense, we determined the addition of CaCO3 in frank soils samples allows the identification of greater diversity and bacterial richness (10 bands) than the other method. Besides, PVPP pretreatment is no only useful to obtain bacterial diversity in sandy soil (8 bands), but also in clayey soils (3 bands) soils by PCR-DGGE method. This indicates that the pretreatment procedures with CaCO3 and PVPP are specific for soil microbial community's isolation.